微生物所噬菌体按捺细菌CRISPR-Cas体系机制研讨中获发展

  原核生物经过一系列的防护体系来反抗噬菌体等寄生生物的进犯。与真核生物的免疫体系相似,原核生物的防护体系也能够分为天然免疫体系和取得性免疫体系。天然免疫体系又包含限制性润饰(Restriction-Modification, R-M)体系、DNA搅扰、毒素-抗毒素体系等,对错特异性的防护办法;而取得性免疫体系是高度特异性的防护手法,其典型代表为CRISPR-Cas体系。近年来,针对CRISPR-Cas体系的效果机制研讨取得了一系列发展,这类体系的序列特异性核酸剪切活性能够对多种细胞和生物的基因组进行有用修改,在基因工程和生物医学等多个范畴显现出了巨大运用潜力。其间最受重视的是Cas9(type II)和Cas12a(type V)体系,二者都被规划和改形成高效精准的基因修改东西,而Cas13a(type VI)体系也被开发成为高灵敏性的核酸检测体系。

   为了逃逸宿主的CRISPR-Cas免疫效果,噬菌体也进化出了多种anti-CRISPR(Acr)蛋白来按捺宿主菌体内CRISPR-Cas体系的功用。目前为止,研讨人员已发现了一系列针对type I和type II CRISPR-Cas体系的Acr蛋白,而且其间多个Acr蛋白的按捺机理已被说明,具有十分显着的特异性和多样性。2018年,Jennifer A. Doudna和Joseph Bondy-Denomy两个课题组别离使用不同的办法发现了三个靶向type V效应蛋白Cas12a的Acr蛋白(AcrVA1、AcrVA4、AcrVA5)并在哺乳动物细胞内显现出有用按捺活性。随后,Dong等人发现AcrVA5经过对Cas12a进行乙酰化润饰来影响PAM基序的辨认,然后按捺靶标双链DNA(dsDNA)的结合。一起,Knott等人报导AcrVA1能够剪切与Cas12a结合的CRISPR RNA (crRNA)的spacer序列,然后阻断DNA靶标链与crRNA互补配对;而且他们经过生化试验证明了AcrVA4能够影响靶标DNA的结合,但其详细效果机理仍不清楚。此外,在这三个Acr蛋白中,AcrVA4具有最高的按捺功率,而且能一起按捺莫拉氏菌(Moraxella bovoculi, MbCas12a)和毛螺菌编码的Cas12a(Lachnospiraceae bacterium, LbCas12a)蛋白活性,而LbCas12a已被广泛运用于多种细胞的基因修改。因而,提醒AcrVA4按捺Cas12a活性的分子机制关于开发有用的基因修改调理东西具有重要意义。

  经过体外结合试验,我国科学院微生物研讨所中科院院士高福与研讨员施一团队发现AcrVA4能够与LbCas12a-crRNA二元复合物以及切开前后两种状况的LbCas12a-crRNA-dsDNA三元复合物结合,可是不能结合单纯的Cas12a蛋白,标明AcrVA4辨认Cas12a的特定构象。随后,研讨人员使用冷冻电镜单颗粒三维重构技能,解析了AcrVA4与LbCas12a-crRNA结合的原子分辨率的三维结构。结构显现AcrVA4以同源二聚体方式存在,而且与一个或两个LbCas12a-crRNA二元复合物进行结合。在两种方式的复合体中,AcrVA4经过相似的机制与Cas12a相互效果,标明两种结合形式具有相同的按捺效果(图1)。进一步结构剖析标明,AcrVA4使用其C端结构域与LbCas12a的多个结构域发作相互效果并确定其构象,然后阻挠靶标DNA与crRNA的spacer序列进行互补配对,然后阻断DNA切开反响。风趣的是,当AcrVA4与切开前状况的LbCas12a-crRNA-dsDNA三元复合物(R-loop状况)相互效果时,能够将结合的dsDNA剥离下来,然后解救被捕获的靶标DNA使其不被切开。此外,AcrVA4还能与切开后的LbCas12a-crRNA-dsDNA复合物结兼并具有较高亲和力,这可能会搅扰Cas12a被新的crRNA重置,阻断酶的循环使用进程(图2)。

  该项作业体系地研讨了AcrVA4按捺CRISPR-Cas12a体系的分子机制。与其他已知Acr蛋白的单一按捺机制不同,AcrVA4能够在反响进程中的多个过程影响Cas12a发挥活性。这些发现拓宽了人们关于Acr蛋白效果机制的了解,为规划可调控的基因修改体系供给了重要理论基础。相关效果已在《美国国家科学院院刊》(PNAS)杂志在线宣告,题为Structural insight into multistage inhibition of CRISPR-Cas12a by AcrVA4。微生物所助理研讨员彭如超、我国科学院大学存济医学院博士生李志腾和我国科学技能大学博士生徐颖为论文一起榜首作者;高福和施一为论文一起通讯作者。此外,南边科技大学冷冻电镜中心主任王培毅和微生物所研讨员齐建勋等也供给了大力支撑。该项目取得中科院要点战略性先导科技专项(B类)、国家科技严重专项、国家自然科学基金委优秀青年基金项目和青年科学基金项目、我国科学技能协会青年人才托举工程项目和中科院青年立异促进会等的经费支撑。

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图1 AcrVA4与LbCas12-crRNA结合的复合体三维结构

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图2 AcrVA4按捺Cas12a活性的作业模型